RAS基因在结直肠癌发病机制中的作用及其检测指南和治疗影响

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  摘要
  RAS家族是包括结直肠癌在内的所有人类恶性肿瘤中最常见的突变之一。在正常细胞中,RAS蛋白可在胞内信号传递的过程中起着连接的作用,它能够将生长因子和细胞膜受体结合,从而调控细胞的生存。RAS的同工蛋白质尽管在形态学上有着很强的相似度,但是在不同的组织中有着不同的功能。一些报道认为,RAS突变在结直肠癌的发生和进展中具有重要的作用。在结直肠癌患者中进行RAS基因突变的检测,特别是KRAS和NRAS的检测具有重要的临床意义。目前建议只有RAS基因野生型的结直肠癌患者才能从抗表皮生长因子(EGFR)受体单克隆抗体的临床治疗中获益。尽管进行了数十年的研究,但目前还没有一种安全有效的治疗能够直接针对RAS突变的癌症患者。多个针对RAS突变的治疗方法目前还处于实验阶段,包括一种应用T细胞来针对转移性结肠癌患者的免疫疗法。
  引言
  结直肠癌发病率在美国人口的常见癌症中位列第三,致死率位列第二。美国最新的癌症统计数据预测,2018年美国将会有237470人口被诊断为结直肠癌,50630人死于结直肠癌。结直肠癌的发展是由多种遗传和环境因素间的相互作用而导致的。遗传性和散发性结直肠癌发生、发展是和基因改变相联系的,这一研究理论在近几十年来已经得到广泛的认可。结直肠癌的发展通常是多步骤的,涉及到多种促癌基因和抑癌基因的突变。大量的研究中所获得的转录组数据将结直肠癌分为四种分子亚型,称为结直癌的共识分子亚型(consensus molecular subtypes (CMS)):CMS1为微卫星不稳定型,主要为多种类型的突变,高甲基化和BRAF突变;CMS 2,3和4主要为染色体不稳定型,主要基于不同的基因表达信号来划分。大多数KRAS突变的结直肠癌归类于CMS3亚型。结直肠癌中复发体细胞的基因改变导致肿瘤形成主要是通过调控细胞中不同的信号通路来实现的。一部分RAS家族的基因受到RTK-RAS信号通路的调控,约52%的结直肠癌携带有RAS基因的突变。
  正常状态的RAS基因和蛋白
  RAS家族由三种基因组成:KRAS,NRAS和HRAS。Kristen 鼠肉瘤病毒 (KRAS)和Harvey鼠肉瘤病毒(HRAS)已经被发现了40多年。NRAS (成神经细胞瘤RAS病毒癌基因)后来被发现是RAS家族的第三个成员。
  RAS基因编码四种同工蛋白质:K-RAS4A,K-RAS4B,H-RAS和N-RAS。它们之间82-90%的序列相似(图1)。这些蛋白通过将生长因子和膜表面受体连接,从而激活胞内信号转导。它们能够传递与细胞存活,衰老等功能相关的信号。
RAS基因在结直肠癌发病机制中的作用及其检测指南和治疗影响
  图1 ?KRAS基因的基本结构(上图)。由蓝色矩形表示的外显子是编码蛋白质的外显子,含有或排除外显子4a的不同剪接导致了两种KRAS亚型:KRAS4A和KRAS4B。指南推荐检测的外显子也包含在检测内。下图为KRAS蛋白两个结构域的基本结构,G区(GTP结合域),在4个RAS异构体蛋白(前85个氨基酸100%,整个G区域~100%)和末端带有CAAX基序的高变区之间具有相似的结构,形成了靶向部分膜蛋白。
  很多证据表明,尽管这些同工蛋白质拥有相似的序列,但是它们在不同组织的正常阶段或者癌症阶段都具有完全不同的功能,而这些不同的功能可以部分归因于这些蛋白C-末端的高度可变区的不同。
  RAS蛋白属于GTP结合蛋白,GTP酶的功能较弱,这些蛋白能够在活性和非活性的两种状态进行转变。这种转变的机制由这两类蛋白的活动补充:能够通过水解和释放GTP而关闭信号的GTP酶活性蛋白,以及通过形成RAS-GDP复合体而开启信号的鸟嘌呤核苷酸转换因子。
  RAS蛋白的功能发挥主要通过两种主要的信号通路:有丝分裂原激活蛋白(MAPK)和磷脂酰肌醇激酶(PI3K)。本文不再继续深入讨论这些信号通路。图2展示了RAS蛋白作为转导者,通过MAPK和PI3K信号通路与不同的胞内效应器相联系的简单图示。
RAS基因在结直肠癌发病机制中的作用及其检测指南和治疗影响
  图2 RAS 蛋白作为连接多个下游效应器的信号转换器的作用。两个下游效应器通路通常涉及结直肠癌的发病机制和调控细胞生存。AF6、Afadin、AKT、蛋白激酶B;表皮生长因子受体EGFR;ERK,细胞外信号调节激酶;Gab2:Grb2相关结合蛋白2;GDP,二磷酸鸟苷,磷脂酶C;GF,生长因子;GTP,三磷酸鸟苷,guanosine-5三磷酸;MEK,丝裂原活化蛋白激酶;PI3K, hosphatidylinositol(3、4、5)联结;PKC,蛋白激酶C;RalGDS, Ral鸟嘌呤核苷酸解离刺激剂;RAF,快速加速纤维肉瘤;RIN1,RAS,RAB interactor-1;Shc、Src同源蛋白、胶原蛋白;SOS,编码鸟苷酸释放蛋白的基因SOS的产物;TIAM、t淋巴瘤侵袭转移诱导蛋白。
  RAS突变和结直肠癌的发病机制
  RAS基因的突变是在恶性肿瘤中最早被发现的基因之一,也是恶性肿瘤中最具代表性的的基因,在所有的人类肿瘤中RAS基因的突变率约占到25%。RAS家族基因的突变频率在不同的恶性肿瘤中差异很大,其中以KRAS突变的频率最高。在胰腺导管癌中,KRAS突变率达到100%,在黑色素瘤中,NRAS突变率达到94%。尽管三种RAS亚型在健康状态和癌症发病机制中存在一定的功能差异,但是这些基因的突变也可能影响相同的氨基酸结构域。大多数RAS突变只发生在三个密码子中,12,13(外显子2)和61(外显子3)。其他少见的突变位点还有密码子59(外显子3)和密码子117,147(外显子4)。
  KRAS在结直肠腺癌的发生发展中具有重要作用。研究表明,KRAS突变率在较大的腺瘤中高于较小的腺瘤。
  结直肠癌中,KRAS和NRAS突变率分别为44.7%和7.5%。大多数KRAS的突变位点在密码子12和13。KRAS在结直肠癌中的重要作用在动物实验中也得到证实。一项研究表明,尽管单独KRAS突变不足以在小鼠中引发肠癌,但是在APC敲除的小鼠中继发KRAS突变,能够导致腺癌并合并有高级别增生瘤变的情况。
  KRAS基因除了在肿瘤的发展中起作用,在肿瘤的转移中也起着重要的作用。动物模型实验结果证实KRAS表达缺失在原发和转移性的结直肠癌中,能够促进细胞的凋亡。KRAS突变除了在肿瘤进展中的作用外,它们还在维持肿瘤的生长中扮演着重要的作用。KRAS突变的结直肠患者可能有着特殊的临床www.yabo51.com谱,KRAS突变在结直肠癌中多见于在男性和经典型腺癌,分化良好或中分化,以及微卫星稳定型等类型。
  结直肠癌RAS突变检测:指南和新进展
  检测的目的
  RAS基因的突变检测在转移性结直肠癌患者中具有预测价值。针对转移性结直肠癌的一种治疗方式是在标准的化疗基础上添加使用抗EGFR受体单克隆抗体,帕姆单抗和西妥昔单抗。这些抗体已经证实能够提高转移性和野生型RAS(外显子2,3和4不突变)结直肠癌患者的预后。
  检测人群
  美国临床www.yabo51.com学学会,美国www.yabo51.com学家学院,分子www.yabo51.com学协会和美国临床肿瘤学协会(ASCP/CAP/AMP/ASCO)于2017年联合发布了结直肠癌分子检测指南。他们建议所有考虑接受抗EGFR治疗的结直肠癌患者都要对KRAS和NRAS的12,13,59,61,117和146密码子进行检测(表1)。2018年《全国结肠癌综合癌症网络指南》(NCCN)建议对所有转移性结直肠癌患者进行RAS和BRAF检测。
RAS基因在结直肠癌发病机制中的作用及其检测指南和治疗影响
  检测所需的组织类型
  NCCN和ASCP/CAP/ASCO指南推荐原发性或转移性癌症均可进行检测。指南认为经确认后的肿瘤组织,包括福尔马林固定组织或者细胞样本均可用于RAS突变的分子检测。
  测试方法
  RAS检测可以运用多种实验平台,包括AS-PCR,高溶解曲线PCR, Sanger测序,二代测序。这些检测手段的敏感性(84.4%-100%)和特异性(98%-100%)都有一定差异。ASCP/CAP/ASCO的联合指南指出,检测方法必须要检测出样本中RAS基因5%的突变频率(box 1)。
  液体活检
  理论上来讲,从血液样本中检测循环肿瘤DNA(ctDNA)是方便的,同时还能够实时监测肿瘤负荷,演化和异质性。几乎每个病人,包括那些很难进行活检的病人都能进行液体活检。最近,基于血液的RAS检测(液体活检)在转移性结直肠癌患者中展出了较好的功能。一项研究的结果显示,与基于组织的RAS检测相比,使用高灵敏数字PCR显示出90.4%的阳性一致性、93.5%的阴性一致性和91.8%的一致性。
  许多研究也表明,在结直肠癌患者术后液体活检中检测KRAS突变,可以强有力的预测疾病复发。
  结肠癌患者ctDNA的一系列检测和分析也被证明有助于评估治疗反应和监测治疗耐药性的出现。
  Box1 2017年ASCO/AMP/CAP关于结直肠癌RAS检测指南的要点
  1. RAS基因是人类恶性肿瘤中最常见的突变之一,突变率达到25%。
  2. 四种RAS的同工蛋白质(KRASA4, KRASB4, NRAS 和 HRAS)拥有80%相似的序列,但是它们在正常和恶性的组织中有不同的作用。
  3. RAS蛋白在信号转导过程中可以被生长因子所诱导,并起连接作用,从而促使细胞存活。
  4. KRAS和NRAS 在结直肠癌患者中的突变率达到52%,突变最常见发生在外显子2上。
  5. KRAS突变在结肠癌的发生和进展过程中起着重要作用。
  6. 根据最新的NCCN指南,对所有转移性结直肠癌患者均应进行RAS突变检测。
  7. RAS突变的检测样本最好使用石蜡包埋组织,经过确认后的细胞样本也可以使用。
  8. KRAS和NRAS基因的突变检测应包括影响外显子2,3,4的突变 (扩展RAS测试)。
  9. 符合临床要求的检测平台均可使用。
  10. 利用液体活检来检测RAS基因突变效果非常好,有望在不久的将来取代传统的组织检测。
  11. 只有具有野生型RAS基因的患者才应该被考虑抗EGFR治疗。
  12. 至今为止几十年的研究都没有产生出一种有效安全的药物,RAS基因的靶向治疗展现出良好的临床应用前景,目前还处于临床实验阶段。
  KRAS突变作为预后指标
  几篇文章研究了KRAS不同密码子的突变对突变预后的影响价值,以及相同密码子的替代突变对结直肠癌患者预后的影响。密码子12,61突变的患者通常比其他位点突变的患者有较差的预后,密码子146位点的突变有较好的预后。虽然涉及外显子2的突变对预后的不良影响得到了多项研究的支持,但外显子2突变(密码子12和13)对预后影响还没有一致的结果。与胰腺癌不同,在结直肠癌中,研究没有显示G12D和G12V突变差异对密码子2的影响。
  RAS靶向治疗
  基于RAS蛋白在包括结直肠癌在内的多种恶性肿瘤发展中的关键性作用,RAS蛋白可以作为一种治疗靶点。尽管如此,30多年靶向RAS蛋白的研究并没有产生有效和安全的药物。这种失败可以部分归结于RAS蛋白的生化特性。RAS蛋白是一种相对光滑的形状,阻碍着药物的附着,使直接的靶向治疗存在困难。图3显示RAS药物、分子的一些关键类别及RAS基因从发现至今的时间轴。
RAS基因在结直肠癌发病机制中的作用及其检测指南和治疗影响
  图3 RAS基因在人类恶性肿瘤中突变情况。自发现至今研究的时间轴,这并不是一份关于收集大量实验性药物的清单,但是一份主要药物和药物类别的简化时间表。
  最近的研究表明,GTP与RAS蛋白的紧密的联系在一起,小分子抑制剂几乎不可能取代GTP。因此,针对密码子146的RAS的抑制剂已经在开发应用中。其中的一种方法是使用针对KRAS基因的突变位点的药物。这些药物阻碍GTP结合活化KRAS蛋白的形成。其中的一个例子就是干扰KRAS G12D与SOS1(一种鸟嘌呤核苷酸交换蛋白)突变体的反应,从而用来阻止KRAS-GTP的形成。还有靶向KRAS G12C中的半胱氨酸,用于阻止肿瘤组织中常见的RAF基因的激活,从而诱导细胞凋亡。Brito等人提出了另一种方法,通过靶向KRAS启动子区域富含鸟嘌呤的G4结构,降低细胞增殖,促进细胞凋亡。第三个有趣的方法是使用miRNA在体内和体外沉默和抑制KRAS依赖性的细胞生长。Welsch等人于2017年发表了他们发现的一种能够结合活性RAS-GTP蛋白并阻止下游与效应蛋白相互作用的多价小分子。正如他们在文章中解释的,该分子具有靶向活性的毒性作用,需要进一步的研究和开发。(box 2)
  《新英格兰医学杂志》(New England Journal of Medicine)最近发表的一篇文章显示,使用免疫疗法治疗转移性结肠直肠癌是一种很有前景的新方法。作者报告了一例转移性结直肠癌患者输注KRAS突变特异性T细胞后导致肿瘤消退的报道,这给免疫治疗作为转移性结直肠癌潜在治疗方式的应用带来了新的希望。尽管在过去的几十年里进行了大量的努力和广泛的研究,但是仍然没有直接或间接针对RAS基因突变的有效药物。
  Box2 RAS基因的扩展检测在现行的指南中和以往指南中的比较
  1. 所有转移性结直肠并考虑用抗EGFR治疗的患者均应进行检测。
  2. RAS突变的检测样本最好使用石蜡包埋组织,经过确认后的细胞样本也可以使用。
  3. KRAS和NRAS基因的突变检测应包括影响外显子2,3和4的突变 (扩展RAS测试)
  4. 符合临床要求的检测平台均可使用。
  总结
  KRAS和NRAS突变率在结直肠癌患者大约为52%,通常涉及密码子12,13,61。RAS基因的结构和功能自几十年前被发现以来就得到了深入的研究和描述。他们在恶性肿瘤(包括结直肠癌)发病机制中的作用已被包括动物模型在内的许多研究证实。KRAS和NRAS扩展检测现在被认为是考虑使用抗EGFR受体的单克隆抗体的IV期结肠癌患者抗肿瘤治疗的标准。尽管在过去的几十年里进行了大量的努力和广泛的研究,但是仍然没有合成一种能够直接或间接针对RAS基因突变的安全并有效药物,不过最近几年,靶向KRAS突变的免疫治疗在实体瘤中的显示出了新的动态和重大进展。
  本文出自于Saeed O, Lopez-Beltran A, Fisher KW,et al. RAS genes in colorectal carcinoma: pathogenesis, testing guidelines and treatment implications. J Clin Pathol 2018;0:1–5. doi:10.1136/jclinpath-2018-205471.

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